皮革與膠原等電點的測定方式探討論文
等電點(IsoelectricPoint，PI)是兩性電解質的特徵物理引數。兩性電解質在電場中不發生遷移時其溶液或懸浮液所處的pH值為該兩性電解質的等電點［1］。此外還有另外一些對等電點的定義，如Michaelis［2］將等電點定義為溶液中兩性電解質的正離子與負離子的數量相等時氫離子的濃度。Sorens-en等［3］對等電點的定義則是溶液中兩性電解質的平均價態為零時的氫離子濃度。這些定義都與電泳時兩性電解質的零位移相一致。對於固體材料，如陶瓷或皮革，其表面有不同的極性基團，這類材料的等電點被規定為當物體表面不帶有淨電荷時的pH值［4］。
蛋白質是一種典型的聚兩性電解質。蛋白質肽鏈的兩端有遊離的氨基和羧基，側鏈上更帶有若干酸性基團和鹼性基團，這些基團都具有放出或接受質子的性質，當蛋白質溶液的pH值達到某一特定值時，蛋白質分子不帶淨電荷，此時的pH值即為蛋白質的等電點。不同的蛋白質由於所帶酸性和鹼性基團不等，而等電點不同［5，6］。等電點特性是蛋白質極其重要的性質，對蛋白的分離、純化和分析等都具有重要的實用價值［7］。
1膠原及皮革等電點及其與製革的關係
作為動物皮製革的物件，是由膠原蛋白聚集而成的膠原纖維束編織而成，膠原蛋白和由其聚集而成的膠原纖維皆具有一定的等電點。對天然膠原等電點的認識經歷了較長的一段時間，這是因為在最初的研究過程中所使用的樣品為經過鹼處理之後的皮粉，現在我們知道天然膠原的等電點在6．5～7．8［8］。製革過程中由於酸、鹼、鹽以及鞣劑的作用，天然膠原的等電點會隨著處理條件的不同而發生不同的改變。如，用鹼法制得的明膠其等電點為4．7～5．2，酸法制得的明膠等電點在7～9左右［8］。在浸灰過程中，鹼能促使膠原主鏈或支鏈上醯胺鍵水解，產生遊離的羧基而氮原子以氨氣的形式揮發出來，從而導致膠原分子中的羧基數量相對增大，進而使得膠原和裸皮表面的等電點向低pH值的區域偏移［9］。膠原蛋白的等電點及其在製革過程中發生的變化對製革工藝的制定很重要。製革的很多工序的工藝是根據皮膠原所處的等電點來進行設計的。
製革操作過程中的特定pH值使得皮膠原帶有正、負或不帶電荷，從而實現皮膠原與相應的皮革化學品發生反應，達到製革的目的。例如，脫灰、軟化後裸皮的pH值約在7．5～8．5之間，而裸皮的等電點在pH值5左右，此時裸皮仍處於鹼性狀態。如果脫灰、軟化後進行鉻鞣，裸皮的pH值顯得高了，鉻鞣劑將在裸皮表面富集，難以滲透至皮纖維內部，有產生過鞣的危險。裸皮的浸酸就可以脫去軟化後的裸皮中剩餘的鹼，以實現裸皮pH值的繼續下降，保證鉻鞣的需要［10］。
鞣劑與膠原纖維作用前後，皮革的等電點將發生較大的變化。如浸酸裸皮的等電點為5．5左右，而鉻鞣後皮革的等電點變為7．0左右，植鞣後皮革的等電點變為3．2～4．0［11］。鞣劑鞣製後皮革的等電點發生變化，可能是因為鞣劑與皮膠原分子某些帶電荷的基團發生了結合，而使這些基團封閉不能離解。因此，可以根據等電點的變化情況瞭解膠原分子上有多少這樣的基團與鞣劑發生了反應，這些基團的性質如何等等資訊，為揭示製革化學中關鍵的鞣製機理問題提供重要線索。
目前關於皮革及膠原等電點這一基礎資料仍較混亂，不同等電點的表徵方法所得資料相互之間缺乏可比性，下文將對目前表徵膠原及皮革等電點的方法進行綜述。
2可溶性膠原及其降解物的等電點表徵方法
蛋白質的等電點可以透過實驗測定，也可以根據其氨基酸組成進行理論計算得出。可溶性膠原及其降解物等電點的表徵方法進行總結如下。
2．1實驗測定
根據等電點的定義，可以用電泳方法來直接表徵可溶性蛋白的等電點，但大多數研究的膠原及明膠的等電狀態是利用其物理效能和化學活性在等電點時發生巨大的`改變而獲得。如:黏度最小、膨脹度最小、滲透壓最低、電導率最小、濁度最大等。當用這些測定的資料對pH值作圖，在鄰近或等電點處曲線都有一個劇烈的下降或傾斜。以下對一些常用的測定等電點的方法分別進行介紹。
黏度法［12］:明膠稀溶液的黏度隨溶液pH值改變而發生變化，是由於明膠分子帶電而使其產生變形的結果。在等電點附近時，明膠分子為電中性，分子收縮，所以黏度最低;當偏離等電點使pH升高或降低時，黏度都增加，這是由於明膠分子的淨電荷隨pH變化而增加，靜電排斥力使得明膠分子鏈展開的緣故。例如配製一定濃度的明膠溶液，在不同pH值條件下用毛細管黏度計，通常為奧氏黏度計測定其相對黏度，將所得的各pH值條件下的相對黏度對pH作圖，找到最低相對黏度時的pH值，此pH值即為明膠的等電點。乙醇
沉澱法［13］:明膠易溶於水，即使處於等電點附近仍能溶解成為均勻的明膠水溶液，但當加入沉澱劑無水乙醇時，即產生明顯易見的白色沉澱。乙醇沉澱法的原理是明膠溶液產生白色沉澱所需的無水乙醇耗用量，在處於等電點時出現極小值，以此來確定明膠的等電點。不同pH值的明膠溶液各取5mL置於比色管中，加水5mL，搖勻，向試樣溶液中逐滴加入無水乙醇直至出現可見的白色沉液為止。記錄膠液的pH與所耗用的無水乙醇毫升數，繪製乙醇消耗毫升數－pH值關係曲線，取最低點對應的pH值即為明膠等電點。
乳光法［13］:在較低溫度時，溶液濃度不低於0．5%的情況下，若介質pH在等電點附近，明膠大分子會發生暫時的絮凝。這是因為，等電點時明膠大分子中正、負離子數相等，分子鏈構象呈最捲曲狀態，形成具有定向排列的複合膠團點陣，透過膠團表面間的側基及氫鍵相互連線、聚集，而處於準絮凝狀態．當光線入射時出現乳白色散射光。配製一組濃度相同而pH範圍在3～7之間，相鄰兩試樣的pH差為0．2～0．3的明膠溶液，等體積吸取各試樣溶液於比色管中，放於冰水浴中冷卻使其凝凍，取乳白光最強者的pH值為試樣的等電點。
滴定法:劉白玲等［14］將酶法提取的豬皮膠原重新溶解在0．5mol/L的醋酸中，得澄清溶液，以6mol/LNaOH滴定，直至膠原溶液出現沉澱，且沉澱不再溶解，測定此時的pH，重複測定3次，取平均值，即為該膠原的等電點。用該方法測得胃蛋白酶提取的豬皮膠原其等電點為4．98。王碧等［15］配製一定濃度的不同膠原蛋白及多肽溶液，分別用標準氫氧化鈉溶液滴定，繪製電位滴定曲線，並做一次微商曲線，確定各膠原蛋白及多肽溶液的滴定終點。進而確定氨基(NH2－)和羧基(－COOH)的表觀平衡常數K1和K2，據此求得各樣品的等電點pI=(pKl+pK2)/2。
熒光法［16］:有實驗表明，在一定的pH值範圍內，明膠的熒光強度與其黏度之間應呈現相反的變化趨勢，所以測出不同pH值下一定濃度的明膠溶液的熒光強度，並測出對應的黏度值，熒光強度最大處和黏度最小處應對應於同一pH值，此pH值即為該明膠的等電點。
等電聚焦法［17］:等電聚焦(IEF)是一種高解析度的蛋白質分離分析技術，它是利用蛋白質分子或其它兩性分子的等電點的不同，在一個穩定連續的、線性pH梯度中進行蛋白質的分離。氨基酸側鏈在不同的pH環境中所帶電荷不同，在蛋白質處於等電點時，它的淨電荷為零，在電場中也就停止了泳動。因此可透過測定其淨電荷為零時所處的環境pH值而測定出該蛋白的等電點。等電聚焦的實施方法可以是園盤電泳，平板電泳以及毛細管電泳，其關鍵點是需要在凝膠中形成連續穩定的線性pH梯度，這需要在凝膠中新增一定的載體兩性電解質實現。
其它鞣劑鞣製研究方面，郭文宇等［18］使用等電聚焦法測定了不同鞣劑鞣製明膠溶液的等電點。各鞣劑對明膠處理後等電點的變化可以看出，膦鹽鞣製體系不同於鉻鞣以及單獨的醛鞣體系。採用膦鹽鞣製後皮膠原的等電點先下降後升高，而甲醛作用後明膠的等電點隨著甲醛的用量的增大而逐漸降低，鉻鞣過後明膠的等電點逐漸升高至6．5左右。
從等電點的定義出發，可知採用等電聚焦法進行等電點的測定，所得結果精確性較高，但等電聚焦方法過程複雜，需要標準的pI兩性電解質，實驗過程中需要防止對流擴散，而且對樣品有一些特殊要求。其它實驗方法實施起來相對簡單，但存在誤差較大的問題。由於蛋白質各種物理性質的不同，使得不同方法測定的等電點在數值上存在差異，可能也是膠原等電點這一基本資料一直以來眾說紛紜的根源所在。
2．2理論計算
蛋白質都具有特定的氨基酸組成和排列。考察蛋白質等電點可以根據其氨基酸組成，將鹼性氨基酸和酸性氨基酸殘基的pKb和pKa值分別找出，然後進行理論計算，可以得到該蛋白質的理論等電點。將理論計算得出的等電點與實驗測定得數值進行比較可以揭示蛋白質分子間的相互作用和構象特徵等資訊［19］。最近有很多這一方面的文獻報到［19－23］。蛋白質等電點理論計算的理論基礎是計算pH梯度的Henderson-Hasselbalch方程［20］。pH=pKa+log(［A－］/［HA］)(1)蛋白質處在等電點時，其分子中帶正電荷的基團總數與帶負電荷的基團總數相等，方程可以表示為:iAi/［1+10(pKAi–pI)］=iBi/［1+10(pI–pKBi)］(2)等式的左邊為酸性基團的加和，右邊為鹼性基團的加和。
組成蛋白質的20種氨基酸中，其中有7種是酸性或鹼性氨基酸，再加上蛋白質兩端未參與成鍵的氨基和羧基，使得需要用9個電離常數來描述蛋白質氫離子的電離平衡。即便這9個電離常數不受介質環境的影響，計算過程也已相當複雜，從而有了各種近似和模擬計算方法［20－23］。
根據其中主要的酸性基團和鹼性基團，離解常數可減少到2個即一個酸性離解常數，一個鹼性離解常數。簡化之後就可以推匯出等電點與這兩個離解常數以及酸性基團和鹼性基團摩爾比之間的表示式。Sillero等［20－21］採用擺動方法(oscillatingmethod)，Patrick-ios和Yamasaki［23］利用非線性迴歸方法，對多肽和蛋白質等電點的計算進行簡化。他們根據蛋白質酸性基團與鹼性基團的比例，分成三種情況，一種是酸性基團遠遠多於鹼性基團(R1)，一種是鹼性基團遠遠多於酸性基團(R1)，還有一種即為兩者數量相近(R→1)。pI=pKa－logR當R1時;pI=pKb－logR當R1時;pI=(pKa+pKb)/2+10［(pKb–pKa)/2］×(1－R)/(2ln10)當R→1時;(3)對這些數值進行非線性迴歸分析。透過對58種已知氨基酸組成的蛋白質的等電點的計算，發現當取pKa=4．9、pKb=10．0時，所得等電點的值與電泳方法測定的值其平均絕對偏差為0．7個pH單位，這一結果與採用不簡化方程的計算結果相當吻合。根據氨基酸組成來進行理論預測蛋白質的等電點沒有普遍適用的方法，因為等電點與氨基酸組成之間的關係複雜，帶電基團在微環境中電離行為也有很大影響。各電離常數的值對蛋白所處微環境的依賴性使得問題相當複雜。這些微環境的影響由相鄰或較遠的氨基酸殘基間存在的分子內靜電引力和疏水作用力導致。對這些作用力進行估算的困難被加重除了與蛋白質肽鏈氨基酸殘基序列有關而外，還與氨基酸殘基在三維空間內的摺疊蛋白質構象的相對位置有關。
膠原蛋白由於其特徵的三螺旋結構，筆者認為要對膠原及其降解物等電點進行相對精確的理論預測，需要考慮膠原特殊的空間螺旋結構對各基團電離常數的影響。
3不溶於水的膠原纖維、皮及皮革等電點表徵方法
以上等電點的實驗測定方法均要求所測試樣在水中能夠溶解，對難溶於水的一類蛋白及其他兩性物質的等電點的測定，實施起來難度就大得多。天然膠原蛋白在水中的溶解效能很差，從動物組織製得的固相膠原纖維要再次溶於水中，溶解度更低。製革過程中的裸皮及半成品均是不溶於水的塊狀固體，為了製革工藝的科學設計和順利實施，需要測定這些處於固態的裸皮或半成品的等電點。
前人對皮革等電點的表徵採用的方法有染色法、滴定曲線法以及等電聚焦法等［1］。對於不溶於水的膠原纖維而言，採用等電聚焦法實施起來有一定的困難，需要以懸浮液來進行電泳，並要求電泳過程中懸浮液中的顆粒不沉降。
Kelly將染料染色方法引入來測定膠原的等電點［24］。該方法的原理是，膠原在偏酸性時與酸性染料結合，而鹼性染料與膠原具有親和力僅在偏鹼性條件下。如當皮粉(浸灰、脫灰處理膠原)的pH值低於5時，發現黃色的酸性染料與其結合，當皮粉的pH值高於5時，紅色的鹼性染料與其結合。所以得出皮粉的等電點為5。用於這一方法的染料需要選擇相對簡單的化合物，與皮膠原只用染料分子中簡單的離子基團相結合。而對較複雜組分的染料，含有配位活性的基團，離子反應不具備相對的選擇性。
Staverman用測量電解電動勢來表徵由豆蛋白、壓緊的皮粉所製成的膜的等電點，或剖層皮的等電點［8］。在原電池中，剖層皮作為膜，將濃度分別為0．1mol/L和0．01mol/L兩種濃度的KCl溶液隔開，用甘汞電極測量兩個半電池的電勢差。為表徵膜的等電點，原電池中注滿已知pH值的適量的緩衝溶液，使緩衝體系的pH值在該膜的等電點附近，以電勢差對pH作圖，曲線在X軸上的交點即為其等電點。
在鉻鞣機理的研究過程當中，用染色技術測定膠原分別經陽離子鉻配合物和陰離子鉻配合物作用後等電點的變化［25］。結果顯示，鉻鞣前的皮粉的等電點在pH值5．5處，經陽離子鉻配合物鞣製後等電點升高到6．5～7．5，經陰離子鉻配合物鞣製後等電點降低到4．0～4．5。這一結果揭示陽離子鉻配合物主要與膠原的酸性基團反應，而陰離子鉻配合物與膠原的鹼性基團反應。充分研究陽離子和陰離子鉻配合物與膠原等電點的關係之後，結果指出陽離子鉻配合物降低了膠原陰離子基團的活性，主要是膠原上的羧基與其反應;膠原的陽離子基團與陰離子鉻配合物反應而使其活性降低。
4展望
至今，可溶性膠原及其降解物等電點的精確測量仍是以等電聚焦電泳方法最佳，如何改進等電聚焦電泳方法的精確性是一個發展方向。毛細管等電聚焦［26］、固相pH梯度等電聚焦［27］等對提高等電聚焦方法的精確性至關重要。固相pH梯度等電聚焦比傳統的等電聚焦具有更高的解析度，其解析度可達0．001pH。
對膠體溶液中粒子的等電點，有人透過測定其zeta電位的變化來表徵［28］，在zeta電位為零時膠體溶液的pH值，即為膠質的等電點，而膠原蛋白溶液即是典型的膠體溶液，從而可以用此方法來表徵膠原蛋白的等電點。程海明等［29］用zeta點位滴定法對膠原及明膠溶液的等電點進行了測定，當zeta點位值為0時的pH為膠原的等電點，並將該方法與等點聚焦法進行了比較。結果表明，用zeta電位滴定法所得膠原等電點值在7．5左右，該值與等電聚焦法所得結果非常接近。另外對金屬氧化物膜表面的等電點，有人採用了測定其不同pH值條件下的接觸角來表徵［30］，其原理是當該膜處在等電點的pH值時，其接觸角最大。透過測定不同pH值條件下的接觸角，找到最大值時的pH值，即為該金屬氧化物表面的等電點。此方法有望作為皮革或其他兩性織物表面等電點的測定方法。
總之，對膠原及皮革等電點的表徵方法仍然需要進行深入的研究，以獲得更為精確的基礎資料。膠原及皮革等電點的研究對製革工藝的制定有重要的指導意義;此外，也對了解膠原分子與鞣劑的相互作用有重要作用，對揭示各種鞣劑的鞣革機理有一定的貢獻。