蘆筍育種中生物技術的運用論文
0 引言
蘆筍是一種全球重要的經濟作物，質嫩味美，營養豐富，被譽為"蔬菜之王"[1].近年來蘆筍種植及加工業在中國發展迅猛，2012年全國蘆筍種植面積已達180 萬畝，是世界第一大蘆筍生產和出口國[1].但是，蘆筍在中國屬於舶來品，商業化生產歷史短，育種工作起步晚，品種資源匱乏，種子問題上受制於人仍是中國蘆筍產業發展的瓶頸之一，亟需加快育種程序，實現良種國產化。
蘆筍是典型的雌、雄異株作物，繁殖過程中長期異交形成基因型高度雜合，即使品種內單株間也存在較大的差異，難以進行嚴格意義上的自交，姊妹交基因純合速度慢。它又是多年生作物，可連續生長10~20年，一般3年後才能測產，需要連續測產3~4年[2].因此，蘆筍育種工作複雜，育種週期較長。近二三十年來組織培養技術成功用於蘆筍的無性繁殖，加速了優良單株的擴繁和利用，花葯培養、DNA分子標記技術以及多倍體誘導等生物技術的應用豐富了育種途徑，蘆筍育種因而取得較大的成就。本文綜述國內外生物技術在蘆筍育種研究上的應用，並分析存在的問題，探討蘆筍育種工作的未來發展方向，以期為今後蘆筍育種研究工作提供參考。
1 組織培養技術與蘆筍育種
1.1 蘆筍莖尖、腋芽離體培養及快繁
蘆筍最初無性繁殖方式只能採用分蔸法，1株生長3~4年的根蔸只能分割出5~6株，分株率低，繁殖週期長，速度慢，嚴重製約著蘆筍種苗繁殖和品種選育，蘆筍組培快繁技術成功應用改變了這一不利局面。誕生於1976年的蘆筍第2代品種'UC157',即世界上第1 個無性系雜交品種（Clonal Hybrids），得益於期間蘆筍組培技術的應用，徹底克服由於姊妹交引起的品種嚴重退化，並解決了親本繁殖問題，從此蘆筍品種選育進入了一個全新階段。
早在1968年Wilmar與Hellendoorn[3]在《Nature》上報道了誘導獲得蘆筍胚狀體，並由此培養出完整的蘆筍植株，蘆筍也成為第1個組織培養成功的單子葉植物。隨後，各國研究者透過莖尖分生組織培養[4]、莖段腋芽培養[5],以及愈傷組織器官發生[6]或體細胞胚胎發生[7]等途徑研究蘆筍組培技術，均成功獲得與親本基因型一致的克隆苗。但是，蘆筍在組織培養中屬於難生根植物，20世紀80年代以前，一直沒有解決組培苗生根難題，因此限制蘆筍組培技術的廣泛應用。1981年周維燕等[8]透過改變激素種類和濃度配比，將蘆筍雞爪根誘導率由20%~30%提高到了44.4%.Chin[9]、Khunachak 等[10]在生根培養基中加入 GA 抑制劑嘧啶醇（Ancymindol）使生根率提高到 90%~100%.
Desjardins 等[11]採用繁殖根叢策略，即首先誘導培養莖段腋芽形成根叢（crown），然後快繁根叢，再誘導生根，極大提高了繁殖係數和生根率。陳光宇等[12]採用繁殖根叢策略和兩段法生根培養，使繁殖係數達到5.3以上，生根率達到100%.最近，Carmona-Martín等[13]開發出一種新穎、快捷、高效的天門冬屬植物組培快繁方法，以植株根莖芽作為外植體，芽誘導和生根均在根莖芽培養基上，整個系統採用一步法，大約8周即可出瓶移栽，平均成活率達80%.Regalado等[14]
進一步優化了該組培快繁方法，以修改的MS培養基作為根莖芽培養基，用85.7 mg/L EDDHA-Fe替代MS培養基中的EDTA-Fe 和維生素，並新增 0.3 mg/L NAA、0.1 mg/LKIN、2 mg/L 嘧啶醇和 6%蔗糖。結果表明：外植體誘導成苗率達70%,一步法生根率為30%~45%;增加一個培養週期生根率提高至60%~85%,增加2個培養週期生根率達到100%;試管苗移栽成活率高於90%.此方法同樣適合於蘆筍栽培品種組培快繁，生根快，週期短，但可能存在繁殖係數不高、外植體不易消毒等缺點。
1.2 蘆筍花葯培養與小孢子培養
蘆筍供體雄株Mm產生2種基因型小孢子M和m,運用花葯培養或小孢子培養技術進行培養，誘導雄核發育，可培育形成單倍體花粉植株M和m,它們經人工誘導加倍處理或自發加倍形成產生雙單倍體植株MM（超雄株）或 mm（純合雌株），進而培育全雄品種（mm × MM→Mm,子代全部為雄株）和強zz優勢組合，加速基因純合，縮短育種程序，因此，花培技術在多年生雌、雄異株作物蘆筍育種中的作用尤為突出。
1.2.1 花葯培養 Pelletier[15]首次採用蘆筍花葯培養成功獲得單倍體細胞團（n=10）。隨後Dore[16]在Pelletier工作基礎上，成功獲得單倍體植株，並透過人工加倍法得到超雄株和純合的二倍體雌株，然後組織培養繁殖DH 單株，雌雄 DH 系配組雜交，獲得早熟高產的全雄組合。1985年Falavigna等[17]透過花葯培養成功地推出'Eros'、'Ringo'、'Golia'和'Argo'4個優良全雄品種。目前蘆筍花葯培養技術已成為國際上蘆筍全雄品種培育主要途徑之一。國內20世紀80年代起，如周維燕等[18]、張磊等[19]、丁鑫等[20]、林宗鏗等[21]、陳海媛等[22]先後開展了蘆筍花葯培養技術研究，對花葯培養的外植體取材與預處理，培養基篩選，誘導培養方法，倍性鑑定與移栽，以及控制體細胞干擾等方面進行了研究，已獲得花葯培養的單倍體和純合二倍體等花培植株。
蘆筍花葯培養一般以小孢子發育處於單核晚或末期的花葯進行接種誘導效果較佳，通常以MS培養基為基本培養基，配以不同的植物生長調節劑組合，誘導雄核發育，透過胚狀體或愈傷途徑，獲得花培苗，其關鍵是雄核發育的誘導，促進小孢子啟動分裂。目前國內較多是透過誘導花葯愈傷途徑[19-22]獲得花培植株。
彭新紅等[23]則是透過誘導蘆筍花葯雄核發育胚狀體途徑獲得花培植株，建立了一種效率較高的花葯培養誘導胚狀體方法，篩選出較優的花葯胚狀體誘導培養基是MS培養基，另新增0.01 mg/L NAA、2.0 mg/L 6-BA、1.0 mg/L 2,4-D、50 g/L 蔗糖。最近 Ercan 等[24]結果表明，小孢子處於單核末期的花葯在添加了0.5 mg/L BA和1 mg/L NAA的MS培養基上培養，胚狀體誘導率最高，達到8.33%,最後成苗率達到13.33%.
1.2.2 小孢子培養 小孢子培養能夠較好避免體細胞干擾。閆鳳英等[25]對蘆筍花粉粒進行離體培養，誘導產生了愈傷組織，經再分化培養形成單倍體植株（n=10）。Zhang 等[26]研究報道，蘆筍遊離小孢子在新增1.0 mg/L 2,4-D 和 0.5 mg/L BA 的液體 MS 培養基中誘導培養，獲得高頻率的小孢子胚和愈傷組織；將愈傷轉移至新增1.0 mg/L 2,4-D和0.2 mg/LBA的固體MS培養基上培養，6周後獲得單倍體再生植株。Peng等[27]
研究表明，培養基成分、花蕾低溫預處理時間、花葯共培養時間等因素均影響蘆筍小孢子分裂頻率和愈傷組織產率，最優處理是：基因型G459花蕾4℃低溫預處理7~9 天，在含 6%蔗糖、1 mg/L NAA、0.1 mg/L 6-BA 的液體培養基上共培養花葯與遊離小孢子14天；4天后2%遊離小孢子分裂形成小愈傷組織；每 100 個花葯產生約140塊愈傷組織；在4種再生培養基上培養，分別有19.6%~21%和3.9%~8.0%愈傷組織產生了幼苗和胚芽；最後成苗的植株中，單倍體佔49%、二倍體佔34%、三倍體佔4%、四倍體佔11%.湯泳萍等[28]研究表明，單核晚期是蘆筍遊離小孢子培養適宜發育時期，小孢子變溫預處理效果顯著，小孢子啟動分裂（膨大率）比對照高出6倍，最高達22.5%,小孢子培養的適宜培養基為新增0.5 mg/L 6-BA、1.0 mg/L NAA、0.2 mg/L 2,4-D、400 mg/L Glu 和 6%蔗糖的 MS 培養基。
1.3 原生質體培養
原生質體培養可為蘆筍遺傳育種創造細胞無性系變異和突變體，為基因工程提供理想的'受體，以及奠定細胞融合工作基礎。蘆筍品種資源遺傳背景狹窄，透過原生質體融合有助於克服種間雜交障礙，打破傳統育種的限制，引進近緣野生種優異基因，創制優異新種質新材料，培育優良新品種，因此，蘆筍原生質體培養是一件非常有意義的研究工作。早在1975年Bui等[29]從蘆筍擬葉的葉肉細胞分離得到原生質體，培養形成愈傷組織，並由愈傷組織誘導獲得了再生植株。由此，蘆筍成為第一個原生質體培養成功的單子葉植物。楊麗軍和許智宏[30]利用蘆筍胚性愈傷組織作為分離原生質體的起始材料，建立了合適的原生質體培養系統。
Chen 等[31]研究表明，KM8P是蘆筍原生質體培養比較適宜的培養基，培養 2 天的原生質體植板率可高達20%,約 25%啟動分裂的原生質體發育形成體細胞胚，共約0.8%最初分離出的原生質體培養再生出完整植株。尹富強等[32]獲得高質量的田間栽植蘆筍嫩莖原生質體。Kunitake[33]電擊法成功誘導A. macowanii與蘆筍栽培種原生質體融合，但獲得的體細胞zz不育。
2 分子標記技術與蘆筍育種
蘆筍重要農藝性狀多為複雜的數量性狀，受微效多基因和環境的共同作用，因此，在遺傳改良中對基因型選擇的依賴性更為突出。藉助現代分子標記技術開展蘆筍分子育種，可以顯著提高選擇效率，縮短育種週期。目前蘆筍分子標記技術主要包括以下2個方面。
2.1 遺傳圖譜的構建
高密度的分子遺傳圖譜是目標性狀基因（QTL）定位、克隆與分子標記育種等研究的基礎。由於蘆筍作圖群體構建困難等原因，已公開發表的蘆筍基因組遺傳圖譜只有4張。Lewis[34]以2個雜合親本雜交F1的部分雙列雜交群體作為作圖群體，運用RFLP標記技術構建了蘆筍首張基因組遺傳圖譜；Jiang等[35]使用同樣的作圖群體，運用RFLP、RAPD和同工酶標記加密了蘆筍第1張基因組遺傳圖譜；Spada等[36]以2個雌雄雙單倍體雜交F1群體作為作圖群體，運用RFLP、RAPD、AFLP 和同工酶標記構建了蘆筍第 3 張基因組遺傳圖譜，總共274個標記定位到10個連鎖群上，總遺傳距離為 721.4 cM,平均遺傳距離和最大遺傳距離分別是7.9 cM 和 29 cM.Mercati 等[37]採用454平臺高通量測序抗、感鏽病轉錄本，檢測出符合分析條件的1800個SNP 和 1000 個 SSR 位點，從中開發出基於 EST 的 144個SNP和60個SSR分子標記，利用239個單株BC1群體將81個標記（65個SNP、15個SSR、1個STS）初步定位在13個連鎖群上，總遺傳距離為773.5 cM,平均遺傳距離是10.2 cM.其中上圖示記可以用來進行種質資源鑑定與遺傳多樣性分析。最近Mercati等[38]利用上述144個SNP對國際上廣泛使用的花葯培養來源的DH 系和品種進行檢測分析，結果證實了現代蘆筍種質遺傳背景相當狹窄，許多 DH 系均帶有早期品種'Mary Washington'的血緣。
2.2 與重要性狀連鎖的分子標記開發與應用
當前蘆筍重要功能基因（QTL）挖掘與標記開發，主要集中於蘆筍性別，其他目標性狀研究幾乎未見報道，由此，蘆筍分子標記前景選擇僅侷限於雌、雄性別。尋找和定位與蘆筍性別決定基因連鎖的DNA分子標記，國內外先後許多研究報道[39-46],目前構建了圍繞蘆筍性別決定基因M比較精細的遺傳圖譜，將M定位在L5染色體著絲點附近的0.63 cM區域內[41],其中開發的部分分子標記已用於雌雄株篩選。國內韓瑩琰等[42]運用BSA法篩選蘆筍雌雄基因池，獲得E-ACG/M-CTT-156 多型性片段與 M 基因連鎖，遺傳距離為8.33 cM.周勁松等[43]利用前人開發的DNA分子標記Asp1-T7 和 Asp1-T7sp 早期快速鑑別蘆筍雌株和雄株，並結合測交篩選出超雄株。李書粉等[44]透過AFLP擴增篩選獲得與蘆筍雄性連鎖的AFLP和SCAR標記。
最近 Kanno 等[45]將蘆筍一個雄性特異 RAPD 標記T35R54-1600 成功轉化為一個 STS 標記 MSSTS710,能 夠 鑑 定 8 個 蘆 筍 品 種 雌 、雄 性 別 ,即'MaryWashington 500W'、'UC157'、'Harumachi Green'、'Super Welcome'、'F4'、'Pacific 2000'、'F2'和'Backlim'.Patricia等[46]利用雄性連鎖標記Asp1-T7和EST-SSR背景選擇標記成功從西班牙本土'Moradode Huétor'兩性株後代群體中篩選到四倍體超雄株。
3 蘆筍的遺傳轉化研究
早在l987年Bytebier等[47]將含有氨基糖苷磷酸轉移酶（NOS-APH）基因的重組質粒pGV3850:1103neo轉化蘆筍愈傷組織，經卡那黴素篩選獲得再生植株，分子雜交證明外源基因整合至蘆筍核基因組上，由此，蘆筍成為第一個轉基因成功的單子葉植物。目前蘆筍農桿菌介導法[47-49]、基因槍法[50-51]、電擊法[52-54]等轉基因技術已比較成熟。其中，Li 等[51]利用基因槍將 NPTII 和uidA 基因同時轉入蘆筍懸浮細胞中，獲得 10 個轉基因植 株 ,在 莖 和 擬 葉 中 均 檢 測 到 uidA 表達 .
Mukhopadhyay 等[52]利用電擊法將NPT II和GUS基因匯入蘆筍胚性愈傷產生的原生質體中，並獲得轉基因再生植株。由於蘆筍是異交授粉植物，轉基因植株後代遺傳規律相對複雜。Limanton-Grevet與Julien將含3~4個T-DNA複製的6個轉基因植株與非轉基因植株雜交，獲得6株T1植株，分析它們GUS活性和卡那黴素抗性，結果發現：3個T1符合孟德爾一對基因1:1分離比例，且T-DNA插入在T0代相同的位點，其他3株則呈現非孟德爾分離；T2代也表現非孟德爾分離；無GUS 活性和卡那黴素抗性的植株，並不含有任何 T-DNA,不適合用來分析非孟德爾分離。但由於蘆筍是蔬菜，涉及到食品安全等問題，國內外尚無轉基因蘆筍品種問世。從長遠發展角度看，國內有必要開展蘆筍轉基因技術研究儲備工作。
4 多倍體育種
蘆筍染色體基數x=10,栽培品種多為二倍體（2n=2x=20），但生產也有些多倍體品種，如紫色四倍體品種'Purple Passion'、'Pacific Purple'、'Sweet Purple',綠色四倍體品種'Seto Green',三倍體綠蘆筍品種'Hiroshima Green',它們一般比二倍體品種植株高大，嫩莖粗壯，筍商品性好。由於蘆筍屬於莖菜，以植物體嫩莖為主要收穫物件，多倍體細胞遺傳學缺陷影響小，且染色體基數較少，多倍體育種潛力較大。
秋水仙素是在蘆筍多倍體誘變中應用較多的化學誘變劑。Braak 等[56]、Skiebe 等[57]以秋水仙素為誘變劑，處理萌發的蘆筍種子，均成功獲得四倍體蘆筍植株。韓成雲等[58]以秋水仙素為誘變劑，用浸泡法和塗抹法處理蘆筍試管苗，進行多倍體誘導。結果表明：以0.10%秋水仙素為誘變劑，用塗抹法處理 72 h 的效果較佳，形態學分析顯示其加倍率可達94%;對多倍體材料進行染色體鑑定，塗抹法染色體加倍效果（細胞加倍率96.1%）也優於浸泡法（細胞加倍率86.4%）。最近Carmona-Martin 等[59]使用秋水仙鹼溶液處理西班牙本土四倍體品種'Morado de Huetor'根莖芽，成功獲得八倍體植株，其中0.1%秋水仙鹼溶液80 r/min旋轉震盪處理 24 h 效果最佳，八倍體誘導率達 7%,混倍體3.5%,獲得的八倍體植株在株高、筍粗、冠層面積等農藝性狀顯著優於原始四倍體植株。
蘆筍多倍體育種另一途徑是透過種間雜交或者不同倍性品種間有性雜交分離獲得。Moreno等[60]研究發現，西班牙本土品種'Morado de Huetor'具有豐富的染色體倍性變異，包括2n=2x,3x,4x,5x,6x,8x等植株，但以四倍體植株為主，這因為'Morado de Huetor'屬於四倍體的蘆筍栽培品種與A. maritimus種間zz，可以從分離出遺傳穩定的多倍體植株。Moreno等[61]利用蘆筍四倍體品種與二倍體品種相互雜交，從zz後代中分離獲得整三倍體植株。
5 小結與展望
綜上所述，現代生物技術在蘆筍遺傳育種中研究應用起步比較早，在單子葉植物中3項第一，蘆筍也堪稱為早期模式單子葉植物，蘆筍育種生物技術已取得較好的成就，併成為蘆筍種質創新與品種改良的重要手段，但是仍存在著一些問題：
（1）進入21世紀，蘆筍原生質體培養、遺傳轉化以及小孢子培養等生物技術研究報道很少，甚至呈現停滯狀態，至今尚無轉基因蘆筍品種問世，蘆筍原生質體融合成功例項也極少。
（2）國外先後報到了蘆筍病毒病AV-1[62]、AV-2[63]、AV-3[64],亟需儘快開展蘆筍脫毒快繁技術研究。
（3）國內花葯培養研究報道不少，實踐中也獲得了單倍體、雙單倍體植株，但成功應用於全雄育種的例項並不多。
（4）分子標記技術在蘆筍上的應用仍落後於其他園藝作物，現有的遺傳圖譜密度過低，分子標記少，除了雌、雄性別，缺乏與其他目標性狀連鎖的分子標記。
鑑於此，並根據蘆筍生物學特性和產業發展需求，建議今後蘆筍生物技術育種工作中重點關注以下方向的研究：
（1）以拓寬遺傳背景為重點進行種質創新，積極開展蘆筍種間雜交技術研究，將近緣野生種質優異性狀匯入栽培品種，綜合運用組培快繁、花葯培養和DNA分子標記輔助選擇等生物技術，提高zz後代目標基因型選擇效率，加快基因純合速度，培育生產中亟需的抗莖枯病、富含功能活性物質等新種質新品系。
（2）國內蘆筍花葯和小孢子培養研究，應致力於解決體細胞干擾、誘導率低、鑑定困難以及移栽成活率低等難題，切實建立起一套可操作性強、行之有效的蘆筍花葯和小孢子培養技術體系，並與蘆筍全雄品種和zz優勢利用實踐緊密結合。
（3）鑑於蘆筍多年生和雌雄異株等生長繁殖習性，人工種子將有良好的應用前景，加強基於體細胞胚發生途徑的組培快繁技術研究，提高體細胞胚誘導率，控制體細胞變異，在此基礎上研發蘆筍人工種子，可能是蘆筍組織培養未來發展方向之一。
（4）蘆筍基因組測序已完成，精細的基因組圖譜即將公佈，以此為研究平臺，積極開發前景和背景選擇標記系統，走向基因組輔助育種和分子設計育種，並融合傳統育種，將是蘆筍新品種培育必然的發展趨勢。
參考文獻：
[1] 陳光宇。中國蘆筍產業發展現狀與趨勢[J].世界農業，2013,10:181-186.
[2] 王小佳。蔬菜育種學（各論）[M]. 北京：中國農業出版社，2000: 241.