生育二孩高齡產婦的遺傳研究論文
隨著國家“全面二孩”政策的落實，要求生育的高齡婦女數量不斷增加，高齡女性生育問題已成為生殖醫學的關注熱點。在對高齡女性開展生育諮詢時，不僅應強調3個增高的風險(不孕率增加、流產率增加、畸形兒增加)，同時還應該告知加強三查，即孕前檢查，植入前遺傳學檢查及產前檢查。隨著分子生物學的發展，越來越多的技術可以幫助解決高齡婦女的生育問題。應用多種遺傳學檢測技術(包括細胞遺傳學、亞細胞遺傳學、生化遺傳學、免疫遺傳學、分子遺傳學等)，結合醫學影像學和計算機資料分析，對準備妊娠夫婦在遺傳諮詢的基礎上，進行孕前檢查;對欲行IVF/ICSI的夫婦進行PGD/PGS及產前篩查和產前診斷;應用現代醫學方法直接檢測胚胎和胎兒，或透過對母體的檢查預測胎兒生長髮育狀況，診斷胎兒是否有缺陷及先天畸形，並提出醫學建議，均可有效降低出生缺陷的風險。本文針對高齡產婦所面臨的問題，就如何開展遺傳諮詢進行討論。
1高齡婦女生育面臨的問題
1.1高齡婦女不孕率增加
高齡產婦(≥35歲)引起不孕率增加主要原因為：卵子老化、卵母細胞質量改變;卵巢儲備功能減退;胚胎種植率下降;染色體分離錯誤，染色體異常機率增加等。在輔助生育技術中，應用IVF/ICSI技術，婦女的年齡是IVF成功與否的重要因素。國內外文獻報道，年齡<34歲成功率高可達50%，年齡≥35歲成功率在30%左右，年齡>40歲成功率10%左右。應用人工授精技術，妊娠率隨年齡的增加而下降，國內外資料各項研究均表明，<30歲的婦女前3個週期的週期妊娠率平均為10%，而≥35歲婦女前3個週期的週期妊娠率則為6%，>40歲的婦女臨床妊娠率明顯下降。可見年齡與妊娠率呈負相關。
1.2高齡婦女流產率增加
據資料統計，流產佔生育夫婦的15%，高齡孕婦流產率為30%～40%。在高齡孕婦流產比例中，僅染色體異常一項就佔50%～80%。高齡會導致致死性染色體異常增加，這些染色體異常胚胎必發生流產。第一種異常為多倍體(三倍體、四倍體)，一般在孕早期就發生流產;第二種異常為單體型，除X單體(45，X綜合徵)部分可以出生外，其它單體一般都導致流產，如21單體就很難出生;第三種異常為三體型，除少數三體(21三體、18三體等)出生為畸形兒外，多數三體如16三體導致流產;此外還有多體型、嚴重的染色體結構異常、嚴重的染色體微缺失、微重複以及其它染色體嚴重畸形，均可導致流產的發生。
1.3高齡婦女畸形兒增加
高齡婦女生育的另一問題是畸形兒出生率增加。年齡越大，卵細胞越容易發生變化，人體包括卵巢所承受的各種有害物質的影響也就越多，這些因素都會使染色體發生突變的機會增多，以及染色體在細胞分裂過程中發生不分離現象等。表現為染色體病患兒出生，如21-三體綜合徵、18-三體綜合徵、13-三體綜合徵、Turner綜合徵、Klinefelter綜合徵、5p綜合徵(貓叫綜合徵)，以及致病的染色體微缺失微重複患兒及其他先天畸形。
2高齡婦女生育對策
2.1高齡婦女加強孕前檢查
遺傳諮詢的目的是透過詢問孕產史，對不良孕產史夫婦及患兒進行遺傳學檢查，綜合年齡及整體情況選擇助孕方式。在遺傳諮詢過程中，主要涉及以下問題：①反覆流產、已生育一個遺傳病患兒，需要對再次妊娠的再發風險進行評估;②親代懷疑為遺傳病，要求確診。對於遺傳病再發風險的估計：染色體病和多基因遺傳病以其群體發病率為經驗風險，而單基因遺傳病則根據遺傳方式進行家系分析，進行發病風險估計並預測其子代患病風險。遺傳諮詢應提供產前診斷方法的有關資訊：根據子代可能的再現風險度，建議採取適當的產前診斷方法，充分考慮診斷方法對孕婦和胎兒的風險等。目前應用於臨床採集標本的方法有絨毛膜穿刺、羊膜腔穿刺、臍靜脈穿刺等，產前診斷方法有超聲診斷、生化免疫、細胞遺傳診斷、分子遺傳診斷等，根據產前診斷結果提供相應的生育建議。
2.2高齡婦女加強植入前遺傳學檢查
隨著女性年齡的增加，胚胎染色體非整倍體的機率增加，導致流產率及生育異常兒機率增加。應用分子生物學檢測技術，對高齡女性進行胚胎植入前遺傳學篩查(PGS)或診斷(PGD)，選擇健康的胚胎移植，達到生育正常後代的目的。PGD 與PGS應用技術相同，主要區別是目標人群不同。PGD是對已知有遺傳致病因素的人群，透過遺傳學篩查達到阻斷相關遺傳病的傳遞，如各種染色體病和某些單基因遺傳病(如血友病、地中海貧血等)。PGS針對的目標人群較廣，通常親代本身並無基因或染色體異常，但高齡、不孕不育、反覆出現染色體異常的胚胎或不明原因複發性流產和反覆種植失敗等。目前PGS篩查內容不針對於特定致病遺傳因素，通常以篩查染色體非整倍體為主，其目的是提高輔助生殖的成功率，未來對高危人群進行單基因病和遺傳基因攜帶者的篩查是PGS的發展方向。
3高齡婦女加強產前檢查
3.1產前篩查
孕婦高齡是產前診斷的直接指徵，但高齡夫婦往往對來之不易的妊娠行有創產前診斷顧慮重重，因此可推薦他們選擇胎兒無創產前DNA(NIPT)檢測。無創DNA檢測是對孕婦外周血中的胎兒遊離DNA的片段進行高通量測序，從而檢測胎兒染色體非整倍體基因。此項技術對21三體和18三體的檢出率及準確率明顯高於孕婦血清學檢查，高齡人群是NIPT最顯著的受益者。
3.2細胞學染色體檢查
隨著女性年齡的增加，胚胎染色體非整倍體的機率增加，產前細胞學染色體檢查是儘早發現異常患兒的.有效措施之一，其分析方便簡捷、結果直觀可靠，是目前國內應用最為廣泛的產前診斷方法。傳統羊水穿刺通常在妊娠16～23周進行，許多中心研究已經證實了羊水穿刺的安全性高、細胞遺傳學診斷精確性高等特點，而且開展細胞學染色體分析技術所需的儀器、試劑、耗材等成本相對較低。細胞遺傳學診斷也存在一些不足和侷限性。首先，標本獲得需要在特定時間，一般在孕18～22周(這個階段羊水比較充足、細胞活性較好)，同時需要較大的標本量且檢測週期長，需要雙平行法進行培養及分析，通常2～3周才能完成分析;其次檢測範圍受限，一般只能檢測>5～10MB的結構異常，對於<5MB的結構異常和一些額外標記染色體的來源則無法明確診斷。此外，染色體核型分析的診斷水平與染色體制備的質量有很大關係。相對於外周血來講，羊水細胞所製備的帶型解析度更低，使得微小結構異常的發現更加困難。有產前診斷研究資料顯示，被認為是“正常”的核型中有10%～16%的染色體結構還存在微小缺失和重複。最後要說明的是，羊水細胞培養有一定的失敗率。
3.3FISH技術檢測
熒光原位雜交技術是將染色體顯帶技術與原位雜交技術相結合，利用DNA 分子鏈中鹼基互補配對原則，用生物素標記探針DNA與目標DNA在一定條件下進行雜交後，在熒光顯微鏡下對待測DNA進行定性、定位分析。可用於中期或間期細胞的分子細胞遺傳學研究。產前診斷中染色體異常通常發生在21、18、13、X、Y 5條染色體上，FISH 技術透過探針標記常見的這5條染色體，用於產前診斷單純高齡因素和唐氏綜合徵篩查高危孕婦，實現快速產前診斷。FISH技術應用產前診斷的主要問題為診斷範圍受限，目前可以明確診斷的染色體種類有限，主要包括13、18、21、X、Y 5種，其它染色體數目異常及結構異常尚無法診斷。而且，由於標記探針位置的限定，上述5種染色體中部分三體的診斷也是FISH 診斷的盲區。如FISH技術標記的18號染色體是著絲粒部位，因此不能診斷18號染色體長臂的部分三體。而且，FISH 檢測價格昂貴，隨著分子生物學技術的發展，FISH 在產前診斷的應用將逐漸被取代。
3.4其他亞細胞及分子學檢測
3.4.1 微陣列比較基因組雜交(aCGH) array-CGH與CGH的原理相似，使用基因組DNA 克隆點制到晶片上(而非細胞中期染色體)製備成array-CGH晶片，array-CGH 結合了CGH 的高通量和FISH 的高解析度等優點，一次檢測相當於對基因組同時進行了成千上萬個獨立的FISH。array-CGH 檢測需要的樣本量少，無需細胞培養，直接提取樣品DNA即可用於實驗，大大縮短了實驗時間。
3.4.2單核苷酸多型性微陣列(aSNP) 單核苷酸多型性(SNP)由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多型性，包括單個鹼基的轉換、顛換以及單個鹼基的缺失和插入。SNP是人類基因組變化最主要的形式，某些SNP直接影響蛋白的結構、表達及遺傳穩定性等。SNP-array晶片是將大量的SNP位點序列採用特殊方法固定在矽晶片上，獲得高密度的SNP微陣列，然後與樣品雜交，透過鐳射掃描、軟體分析獲得結果。aCGH 與aSNP共同點：均為高通量檢測基因組中複製數的改變，都可以檢測染色體數目異常和結構異常及染色體的微缺失及重複等。缺點是不能診斷染色體平衡易位、倒位等，此外由於敏感性高容易造成過度診斷。
3.4.3 基因測序技術 Illumina/Solexa GenomeAnalyzer測序(第二代測序)技術為一種通量更高、速度更快的測序技術，在生物學研究中廣泛應用。基本原理是邊合成邊測序，在Sanger等測序方法的基礎上，透過技術創新用不同顏色的熒游標記4種不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每新增一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根據捕捉的熒光訊號並經過特定的計算機軟體處理獲得待測DNA的序列資訊。基因測序技術提高了檢測的解析度，同時發現大量的小片段的CNVs改變(<1MB)，這些CNVs與疾病的關係目前還難以解釋。某些CNVs屬於良性改變，不具有病理學意義。因此分子診斷實驗室建立自己的實驗平臺及評估方法十分重要，包括是否為新發生的CNVs、是否曾在正常人群中被報道過、CNVs長度大小、是否在文獻庫中有報道、是否遺傳自父母等。對所發現的CNVs的解釋成為實驗室診斷及諮詢人員的最大挑戰，僅從實驗資料得出的結論沒有準確的規律可循，因此主觀正確評估十分必要。
總體來講，第二代測序使時效與通量均獲得增加，實現了快速產前診斷;增加了診斷精度，可實現染色體微小結構異常的診斷和多種出生缺陷的分子產前診斷，將多種技術平臺組合應用，提高了產前診斷水平。
對於高齡婦女生育，遺傳諮詢和指導要貫穿於生育的全過程，結合上述產前診斷方法為高齡婦女生育風險評估提供科學的指導。